La digestibilidad proteica en pepsina sobrenadante es uno de los métodos enzimáticos más utilizados cuando se desea evaluar la calidad proteica de harinas de origen animal, siendo reconocido internacionalmente por la Association of Official Analytical Chemists (AOAC).
El método “in vitro”, acompañado de un sistema enzimático, tiene características similares a las del tracto gastrointestinal. Tiene como gran desafío reproducir, en laboratorio, el mecanismo complejo de digestión que tiene lugar dentro del tracto digestivo de los animales.
Determinado en productos o subproductos de origen animal como harina de carne, harina de vísceras, harina de plumas, harina de sangre y harina de pescado.
¿QUÉ ES LA PEPSINA?
La pepsina es una enzima digestiva producida por las paredes del estómago y secretada por el jugo gástrico, su función es descomponer las proteínas en péptidos más simples. Solo reacciona en un ambiente ácido, por lo que el estómago también produce ácido clorhídrico (HCl). En contacto con el ácido clorhídrico, el pepsinógeno (una enzima inactiva que está presente en el jugo gástrico) se transforma en pepsina, que es activa.
¿POR QUÉ SE DESARROLLÓ EL ANÁLISIS DE DIGESTIBILIDAD EN PEPSINA?
El uso de subproductos de origen animal, como fuente alternativa de proteínas para raciones, además de reducir costos aumenta la rentabilidad de los mataderos avícolas y evita la contaminación ambiental, que podría ocasionarse si estos residuos fueran descartados en el medio ambiente. Las harinas de origen animal son fuentes de calcio, fósforo, aminoácidos y energía.
Conocer la digestibilidad de estas materias primas es muy importante para la elaboración de dietas para bovinos, aves, cerdos, peces o mascotas, ya que los productores necesitan caracterizar correctamente sus productos para cumplir con las especificaciones de sus clientes.
La verdadera digestibilidad es muy difícil y dispendiosa de medir, ya que requiere investigación en animales ("in vivo"), por lo que se han desarrollado métodos rápidos, a gran escala, de bajo costo, reproducibles y basados en laboratorio ("in vitro") para estimar la digestibilidad de varios alimentos, siendo la digestibilidad de la pepsina una de las más utilizados.
METODOLOGIAS
La metodología es ampliamente aceptada por la industria alimentaria porque es relativamente simple, de bajo costo, rápida, porque permite simultáneamente comparaciones entre un gran número de muestras y principalmente, porque sigue el estándar oficial (A.O.A.C - Association of Official Analytical Chemists), asegurando las características de calidad, seguridad y confiabilidad.
¡COMPRENDA CÓMO SE HACE EL ANÁLISIS!
Para que se lleve a cabo la digestibilidad de la pepsina es muy importante que la muestra esté preparada siguiendo los siguientes pasos:
Ø Molienda en molino con refrigeración
o TE-631/4(Figura 1.1)
Figura 1.1. Molino multiusos marca TECNAL
Ø Sistema desengrasante para la determinación de grasas
o TE-045/8(Figura 1.2)
Ø Secado en estufa con circulación y renovación de aire
Figura 1.3. Estufa con renovación y circulación de aire marcaTECNAL
Ø Peso en balanza analítica
Después de la preparación y el pesaje, se realiza la digestión con agitación constante e incubación en frascos que contienen solución de pepsina y ácido clorhídrico, asegurándose que toda la muestra esté en contacto con la solución, en una Estufa para Digestibilidad en Pepsina - TE-029(Figura 1.4), durante 16 horas, a temperatura de 45 ± 2°C, y agitación constante de 15 RPM.
Figura 1.4. Estufa para digestibilidad de pepsina marca TECNAL
Transcurrido el tiempo necesario, se realiza la filtración, con el papel de filtro junto con los residuos, colocados en los tubos de digestión.
Opcional a la filtración, después de la digestión, el contenido del frasco se puede transferir a un tubo de centrífuga y centrifugar a 2.500 R.P.M. durante 15 minutos. Luego, se pipetea una alícuota del sobrenadante en un tubo de digestión de proteínas.
Al final, se lleva a cabo la determinación del nitrógeno Kjeldahl total o proteína bruta en el residuo y en el sobrenadante. Para este análisis, se puede utilizar el sistema macro de determinación de proteínas, que se compone de:
Ø Bloque digestor de 8 pruebas conrampas y niveles – TE-0081/50(Figura 1.5)
Figura 1.5. Bloque digestor marca TECNAL
o Realiza la digestión de la muestra para un análisis posterior de nitrógeno
Ø Galería extractora – TE-008/50-GE(Figura 1.6)
Figura 1.6. Rejilla de extracción de gases macro de marca TECNAL
o Neutraliza y diluye los gases y vapores ácidos de la digestión
Ø Destilador de nitrógeno – TE-0364 (semiautomático)(Figura 1.8), TE-0366 (automático), TE-0365/1 (3 pruebas simultáneas) o Hace la destilación de nitrógeno amoniacal, bases volátiles totales (BVT)
Figura 1.8. Destilador de nitrógeno marca TECNAL
En paralelo, se debe realizar una prueba en blanco involucrando las soluciones utilizadas.
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Cálculos
Digestibilidad en pepsina (residuo) ecuación 1.1 =
Ecuación 1.1
Donde:
A = % de proteína en el residuo con ácido + pepsina
B = % de proteína en el residuo con ácido (sin pepsina)
PB = % de proteína bruta
Digestibilidad en pepsina (sobrenadante) ecuación 1.2=
Ecuación 1.2
Donde:
A = % de proteína en el sobrenadante con ácido + pepsina
B = % de proteína en el sobrenadante con ácido (sin pepsina)
PB = % de proteína bruta
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Referencias
AOAC. Official methods of analysis of AOAC International. Pepsin Digestibility of Animal Protein Feeds (AOAC. Method 971.09). 21th ed. Gaithersburg (MD); 2019.
Compêndio Brasileiro de Alimentação Animal: Guia de Métodos Analíticos. 2.ed. São Paulo: ANFAR, 2005. 204p.